核酸适配体筛选常见问题解答

 

 

大家觉得筛选难吗？

大家回答 难！很难！太难了！ 以下进入正题

 

问题:1：核酸适配体PCR后，什么纯化方式最有效？（还有制备得到的单链用哪种纯化方式好？）

答：罗老师实验室采用过4种方式：1、使用10kd，millipore的超滤管用超滤的方法回收；至于有同学提到的超滤管对核酸的吸附问题，因为无论哪一种方法都是有损失的，只要损失不是太多就可以接受。这种方法得到的单链质量较高。但是成本也较高。

2、使用乙醇沉淀的方法回收；效率还是很高的，方法网上可以查到，只是获得的单链质量可能不稳定，建议大家纯化得到DNA后做紫外光谱扫描，鉴定一下质量，质量高的话再用于次级的文库。

3、使用试剂盒回收（后期咨询得知可以使用一些适用于回收短片段核酸的试剂盒，例如上海生工的“寡聚核苷酸纯化试剂盒”）

4、使用长短链法用变性PAGE电泳回收，得到的单链透析后使用。这种方法得到的单链质量稳定，只是操作步骤较多。

 

问题2：单链制备的方法有哪些？

答：常规有以下几种

1、Biotin修饰引物后用SA磁珠分离方法；有一个问题就是biotin修饰这一条链可能也被洗脱下来，注意一下洗脱时候NaOH的浓度。

2、长短链法；需要电泳跑胶

3、酶解法：实验室使用的是NEB公司的lambda核酸外切酶酶解半小时，成本较低。

4、不对称PCR法：条件不是很好控制，每个实验室都还是要优化条件的。

参考文献：

Marimuthu, C., et al. (2012). "Single-stranded DNA (ssDNA) production in DNA aptamer generation." Analyst.

               The discovery that synthetic short chain nucleic acids are capable of selective binding to biological targets has made them to be widely used as molecular recognition elements. These nucleic acids, called aptamers, are comprised of two types, DNA and RNA aptamers, where the DNA aptamer is preferred over the latter due to its stability, making it widely used in a number of applications. However, the success of the DNA selection process through Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX) experiments is very much dependent on its most critical step, which is the conversion of the dsDNA to ssDNA. There is a plethora of methods available in generating ssDNA from the corresponding dsDNA. These include asymmetric PCR, biotin-streptavidin separation, lambda exonuclease digestion and size separation on denaturing-urea PAGE. Herein, different methods of ssDNA generation following the PCR amplification step in SELEX are reviewed.

 

问题3：磁珠方法筛选适配体，磁珠是一起加入到PCR体系中吗？对PCR的有什么影响吗？

（提问者使用的是300nm的磁珠）

答：一个简单的判断是如果加到PCR mix中，肉眼不可见磁珠的颜色，影响应该是不大的，如果磁珠的量过多，肉眼可以看到mix中浑浊的颜色，那样会对PCR过程产生抑制。

 

问题4：有时在前几轮筛选能看到亲和力提升,为什么再筛选几轮就没有亲和力了？

答：亲和力降低的原因有很多，不同序列扩增效率不同，有一些扩增快有一些扩增慢也会导致亲和力降低。

 

 

问题5：一开始没有什么引物二聚体，忽然从中间几轮开始引物二聚体特别多，连初始文库PCR出来，引物二聚体也是比较多，不知道错在哪里了？

答：有可能后来出现了气溶胶污染。

 

问题6：核酸适配体有动力学特点吗，比如高亲和力的反应速率比低亲和力的反应快？有文献报道吗？

答：有这个特点。但是筛选中要注意的是第一轮筛选的时候，基本都是单拷贝，即使是高亲和力的也不一定保留下来，因为低亲和力的还是更多的。所以第一轮筛选建议是尽量孵育时间长一点，让能结合的尽量能结合并保留下来。

文献可参考加拿大Krylov研究组的文章，做的关于高亲合力和低亲和力的一些理论的验证和解释。

 

问题7：检测亲和力，如果用SPR和CE测的时候 亲和力是不是会差异很大？（ CE用孵育方法）有的时候好像一种方法检测有亲和力，另一种方法检测不到？

答：确实是的，不同方法检测，有时候数据能相差一个数量级。不同方法之间其实也不是很可比的。因为CE里面涉及到一个电场的因素，可能会对适配体的构象产生一定的影响。

实验中对照一定要全面。

 

 

问题8：有哪些方法可以检测亲和力？

答：其实如果亲和力很强的话，跑电泳就可以看到复合物。如果亲和力不强的话，检测起来就需要用到一些SPR,CE,QCM，流式的方法都是可以的，具体到某一种样品，可选择的方法其实又是很有限的。

 

问题9：候选序列太多，怎么选亲和力高的aptamer？

答：重复数是一方面要考虑的，还可以分析数列有没有共有的一些特征（可以用clustalX2 分析序列家族），我们现在都是使用高通量测序，得到的数据量较多。

 

问题10：磁珠法筛选适配体，怎么去除非特异性单链？

答：可以用空白磁珠反筛，比如筛选时候用10ul磁珠，反筛就至少用10ul空白磁珠吧，类似这样的方法。还可以考虑加入鲑鱼精DNA竞争结合。

 

 

问题11：筛选过程中漂洗的力度怎么有效的控制，比如说吹打或者漩涡这么强的力度是不是特异性结合的就直接下来了，保留下来的是和磁珠非特异性结合的序列？

答：罗老师实验室现在清洗力度达到与背景差不多，大约4-8遍。不推荐使用漩涡振荡。实验室现在使用Q-PCR监测清洗的力度，可以知道清洗几遍可以洗的比较干净。

 

问题12：适配体与靶标结合是先形成了三维结构还是边结合边形成三维结构？

答：这个可能没有办法准确的回答你，但是个人认为这两种情况是同时存在的。

 

问题13：筛选出来的aptamer，5端修饰基团对aptamer影响大吗？

答：如果你想对你的aptamer修饰，最好是在开始筛选的时候就修饰上，后期修饰的话，不好说有没有影响，因为可能会影响aptamer的折叠。一般修饰一些小的基团，影响不会很大。

 

问题14：怎么进行筛选进程的监测？

答：监测方面的文章并不是很多，可以通过监测亲和力的方法；也有发表的文章是监测Q-PCR的Tm值等作为判断标准；可参考文章

 [Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection ]

Vanbrabant, J., Leirs, K., Vanschoenbeek, K., Lammertyn, J. & Michiels, L. reMelting curve analysis as a tool for enrichment monitoring in the SELEX process. Analyst 139, 589-595, doi:10.1039/c3an01884a (2014).

Schutze, T. et al. Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing. PLoS ONE 6, e29604, doi:10.1371/journal.pone.0029604 (2011).

 

 

问题15：琼脂糖跑胶怎么目标条带的位置和marker的位置不能很好的对应，目标是86个bp,对应的marker在100左右？

答：建议大家跑这种小片段的用变性PAGE胶，分辨率较高。

 

问题16：筛选一般加多少ssDNA与靶物质结合？10OD够吗？

答：够了，罗老师实验室使用的初始库是1OD，1.3nmol。

 

问题17：筛选膜蛋白，如果买不到现成的膜蛋白，只能通过过表达细胞系来筛选吗?

答：可以使用cell-SELEX，也可以使用表达的这个蛋白的胞外段做筛选。

 

问题18：感觉PCR是一个挑选的过程，在这个过程中会使有效的序列减少，如何能够避免这个情况发生？

答：可以使用乳浊液PCR的方法。

 

问题19：麻烦问一下，哪里可以找到我要检测的目标物的适配体的核酸序列？

答：google搜索：aptamer database

https://www.aptagen.com/aptamer-index

 

 

问题20：国内有做aptamer筛选的公司吗？

答：目前有一些公司在做，但是因为筛选的难度还是比较大的，公司并不多，也有一些实验室，有需要的话可以合作共赢。

笔者注：我们公司可以做全委托筛选，包含aptamer的筛选以及亲和力检测。

 

 

问题21：适配体通过静电作用吸附在纳米金表面，请问为何加入目标分子后，为何其不能脱落下来？

答：这方面没什么经验。可以咨询首都师范大学娄新徽教授，或者上海的樊春海研究员。

 

 

问题22：求指教：适配体上没有任何荧光修饰的情况下，将适配体修饰在纳米磁球上，如何判断适配体是否已经过量？

答：这方面我们做的不是特别多，娄新徽老师有篇文章，用动态光散射判断修饰情况的，可以参考。

应该是这一篇：Wang, W.; Ding, X.; He, M.; Lou, X. H.* Kinetic Adsorption Profile and Conformation Evolution at the DNA-Gold Nanoparticle Interface Probed by Dynamic Light Scattering. Anal. Chem. 2014, 10.1021/ac502440h

 

问题23：筛选最后一轮的PCR产物如果送去高通量测序，罗老师选用的哪家公司？价格是多少？高通量测序需要我们提供两端的固定的序列作为测序引物吗？

答：我们可以自己测序，如果多可以选择测序公司。具体需要和公司技术人员沟通。样品具体需要怎么处理，测序公司会有要求的。

笔者注：我们公司可以做高通量测序，包含测序结果的提取。

 

问题24:污染问题指的是什么，我试验时设置不加文库的对照组，电泳时发现有文库大小的条带，是不是说明体系污染了？筛选中能否看到？怎样避免污染。

答：随着筛选进行，体系会出现污染，还有气溶胶的污染都会影响实验。发现污染后最简单的方法是换个库，但是治标不治本，最重要的还是培养平时的实验习惯，避免高浓度pool的污染。

 

问题25：制备次级文库的时候，进行1次扩增发现量远远不足，于是进行2次PCR扩增，但是有时会出现杂带，比如200、400bp,是否不能继续进行了？

答：用变性胶电泳检测一下，可能是特异产物。这个问题有不少文献中的报告是错误的。如果变性胶检测片段大小没问题，无需重做。

 

问题26. 产物浓度的测定使用Nanodrop，这种方法也不会特别准，会不会影响轮次之间严谨性的递增。

答：尽量要保持每轮筛选的pool之间质量的一致性。没有绝对准确的方法。如果操作稳定，紫外法还是最稳定可靠的方法。

 

问题27. 筛选了10轮，流式细胞术监控荧光强度，发现只有细胞的对照组和筛选二、六、九、十轮的荧光直方图基本重叠，无差异。推断有2个原因：（1）是样本自发荧光与标记荧光重叠，怎样避开生物自发荧光，用什么手段证明标记物？（2）是不是筛选不成功，该如何进行下去？PS.还有什么可选的表征方法？

答：（1）先确定是否有自发荧光，如果真的有自发荧光，可以更换荧光染料。

（2）无法根据以上你提供的信息进行判断筛选是否成功。罗老师实验室建立了一套综合评价方法，可以辅助你决定是否有必要继续进行筛选，需要提供pool和PCR引物，3工作日可出结果。