陆艺：开创DNA适配体胞内应用新方向

今天介绍一篇最新发表在JACS上的文章Genetically Encoded Fluorogenic DNA Aptamers for Imaging Metabolite in Living Cells。文章开发了一种用于活细胞代谢物成像的基因编码荧光 DNA 适配体（GEFDA）传感器，为监测生物系统中的小分子代谢物提供了新工具。

基于荧光蛋白和荧光 RNA 的基因编码传感器在生化和生物医学成像中有重要应用，但存在局限，如蛋白传感器开发困难，RNA 传感器稳定性较低。

DNA 适配体可通过 SELEX 技术更容易获得，能结合多种靶标，稳定性高于蛋白质和 RNA，但目前多数基于 DNA 适配体的传感器需预标记荧光团，存在传递效率和位置不稳定、稀释等问题。

 开发可在大肠杆菌和 HeLa 细胞中实时检测 ATP的GEFDA-dDASA 传感器【dDASA 是对基于 DIRFA 的分裂适配体（DASA）进行二聚化后的产物】，克服预标记 DNA 适配体传感器的问题。

利用 DNA 适配体扩展适配体库，为监测生物系统中小分子代谢物和其他小分子的实时动态提供新工具。

图 1. 基于 DIRFA 的分裂适配体（DASA）传感器的设计与表征。

对比 Lettuce 适配体和二甲基吲哚红（DIR）特异性荧光适配体（DIRFA）在不同缓冲液中的荧光性能，选择 DIRFA 作为信号输出。

对 DIRFA 进行截短分析，发现茎干 D1 对发光效应至关重要，将其与 ATP 适配体连接构建 DASA 传感器，该传感器在 ATP 存在时荧光增强。

优化 DASA 传感器性能，包括改变茎干 D1 区域长度和评估传感器特异性，发现 DASA-3 在 ATP 结合时荧光增强最高，但荧光强度最低，且传感器对 ATP 具有高选择性。此外，还评估了传感器在 37°C 下的性能，发现 DASA 传感器在该温度下荧光强度降低。

2. DASA 传感器的二聚化

图 2. 二聚体 DASA（dDASA）传感器的设计与表征。

二聚化 DIRFA（dDIRFA）在 PBS 缓冲液中荧光强度增加，在细胞裂解液和细胞内稳定性提高，因此对 DASA 传感器进行二聚化（dDASA）用于细胞内应用。

优化 dDASA 设计，选择 dDASA-2 进行研究，发现 10-nt 连接体（dDASA 2-C）性能最佳，其检测范围广、选择性好，且二聚化增强了 ATP 传感能力。

3. 活细胞中 ATP 传感的时间控制

图 3. 利用 DIRFA 评估 DIR 在 HeLa 细胞中的细胞膜通透性。

优化后的 dDASA 传感器转染 HeLa 细胞，通过改变细胞内 ATP 水平，发现 dDASA 可有效感知 ATP 水平变化，且荧光信号变化与 ATP 结合活性相关。

评估传感器的时间控制传感能力，发现其对 ATP 或 DIR 的响应迅速，DIR 可快速穿透细胞膜启动 ATP 传感。

4. 活细胞中 ATP 的实时跟踪

5. 用于细菌细胞中 ATP 检测的 GEFDA 传感器

图 5. 用于监测大肠杆菌中 ATP 水平的基因编码荧光 DNA 适配体（GEFDA）传感器。

将 dDASA 及其变体转化到 DH10B 细菌细胞中，发现传感器荧光增加不明显，推测是细菌细胞分裂导致适配体传感器稀释。

构建基于逆转录酶的系统合成 dDASA，引入 β 蛋白提高单链 DNA 稳定性，发现表达 dDIRFA 的细菌细胞荧光增强，且 dDASA 传感器可有效检测细菌细胞内 ATP 水平，还能区分单细胞分辨率下的细菌亚群。

6. 用于哺乳动物细胞中 ATP 监测的 GEFDA 传感器

图 6. 用于监测 HeLa 细胞中 ATP 水平的 GEFDA 传感器。

将 GEFDA 传感器组件克隆到 pBK-CMV 质粒中用于哺乳动物细胞，发现添加 β 蛋白可增强 dDIRFA 在哺乳动物细胞中的荧光强度。

用 dDASA 替换质粒中的 dDIRFA，发现传感器可成功感知 ATP 水平变化，且能跟踪活细胞中 ATP 动态变化。

开发的 GEFDA-dDASA 传感器可在大肠杆菌和 HeLa 细胞中实时检测 ATP，克服了预标记 DNA 适配体传感器的问题。

利用 DNA 适配体扩展了适配体库，为监测生物系统中小分子代谢物和其他小分子的实时动态提供了新工具。