筛选专题三
长短链法跑胶回收单链DNA--快速切胶、碎胶
背景介绍
核酸适配体筛选过程中，单链制备是非常重要的一步，单链的质量也关乎筛选的成败。
单链制备方法有多种，发表文献里常见的方法有以下几种：
1、Biotin修饰引物后用SA磁珠分离方法；2、长短链法；将反义链加长，需要电泳跑胶分离两条链；3、酶解法：可以使用lambda酶切，成本较低，但是可能出现不完全酶切；4、不对称PCR法：条件不是很好控制。
参考文献Marimuthu, C., et al. (2012). "Singlestranded DNA (ssDNA) production in DNA aptamer generation." Analyst.）
单链制备之长短链法
在核酸适配体的筛选中，只有保证每一轮投入的单链DNA质量都非常高并且稳定，才能保证后面每一步的进行是有用的，如果源头就出现问题，筛选的后面步骤都是在做无用功。
长短链法制备单链的步骤通常包含了配制变性胶，电泳，切胶，碎胶，煮胶。我们对一整套流程进行了优化，大大提升了回收效率，且DNA得率较高，最重要的是得到的单链质量非常稳定！
通常我们的核酸适配体单链长度一般为70-90nt之间，反义链长度加长约20个碱基左右，使用尿素变性PAGE胶电泳使两条链分离后，需要切胶回收我们的目的条带。用常规的凝胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit）来回收琼脂糖凝胶电泳里的DNA条带可谓分子生物学实验中最常见的实验室操作之一，不过如果是聚丙烯酰胺PAGE胶，回收DNA可就麻烦多了。使用电洗脱？要多麻烦就有多麻烦，回收率还低。使用常见试剂盒回收？通常如果凝胶块碾磨不够充分，提取率将会非常低，DNA的量完全不够用于下一轮筛选。
图1：长短链法制备单链流程
我们采用独特的照胶、切胶、碎胶方式，可以将切下来的PAGE胶研磨的非常碎，煮沸后采用正丁醇浓缩纯化上清，简单快速。为保证浓缩后的DNA的质量，我们一般采用透析的办法。DNA浓缩以及微量DNA透析的方法见下一期视频，敬请期待。
使用我们的方法能简单、快速、有效地从聚丙烯酰胺凝胶中回收纯化 DNA 片段。本方法不需要昂贵的设备,避免采用危险性的试剂如苯酚和氯仿,只需少数几个步骤即可完成提取过程。因为是切胶回收目的条带，避免了非目的 DNA 片段、引物、dNTP 等的污染；对单链采用了透析的步骤，避免了其他无关溶剂或者蛋白的污染，纯化得到的 DNA 质量非常稳定，可放心用于下一轮筛选。
图2：紫光设备照射下的ssDNA条带及引物条带
详细的操作步骤请戳视频
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以下视频提供了核酸适配体筛选过程中长短链法制备单链DNA的步骤，供参考借鉴。
相关专题：
第一期 20190321 #筛选专题#乳浊液PCR--内含操作视频
第二期 20190403 #筛选专题#二、乳浊液PCR产物快速高效回收及浓缩--内含操作视频
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