#核酸适配体筛选专题#一，乳浊液PCR--内含操作视频

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乳浊液PCR提高筛选成功率--内含操作视频

背景介绍

核酸适配体（aptamer）是指通过指数富集的配基系统进化技术（Systematicevolution of ligands by exponential enrichment，简称SELEX）筛选分离得到的DNA或者RNA分子，也称为化学抗体。它可以与靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合。与传统的抗体相比，核酸适配体具有分子量小，稳定性更好，无批次间差异性，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。这些优点使其在生物医学领域具有广阔的应用前景，因此在基础研究及应用研究领域均呈现了快速发展的趋势。

SELEX一般包括以下3个部分：（1）随机核酸文库与靶标结合；（2）通过特定的方法将与靶标结合的和未结合的核酸序列分离；（3）将与靶标结合的核酸序列进行扩增，制备成单链投入到下一轮筛选。整个过程步骤繁多，筛选周期很长，且成功率不高，需要几个月的时间才能筛选出与靶标具有高特异性的核酸适配体。

图1 常见的磁珠法筛选流程

对于核酸适配体筛选获得的文库而言，有些序列二级结构复杂，有些序列GC含量不均，有的热稳定性不好，这些因素都会影响PCR扩增效率，使得并非所有序列都能在PCR时以同等的速度扩增。如果有的序列扩增的慢，有的序列却又很容易扩增，随着筛选的进行，很可能有亲和力的一些序列由于PCR的偏好扩增而不被富集最终导致筛选的失败。

核酸适配体筛选中的乳浊液PCR

乳浊液PCR（emulsion PCR）是利用油包水乳液体系中的微液滴作为反应器进行的PCR扩增体系。近年来乳浊液PCR在生物医学领域的应用越来越广，可以实现在每个微液滴中进行单分子模板的扩增反应，从而避免常规PCR扩增过程中出现的扩增偏好（PCR bias）问题，提升核酸适配体的筛选成功率{Yufa, 2015 #1282}。

乳浊液的制备：通常比较简单粗暴的方法是将含有特殊表面活性剂的油和PCR mix放在一起猛烈地振荡，即可得到乳浊液；通过超声的方法也可以得到乳浊液。虽然这样得到的油包水的液滴大小不一，但是对于核酸适配体筛选中的PCR步骤已经可以满足了。需要注意的是如果乳化的不好，只要放置片刻，乳浊液就又会分成两层，这样就达不到预期的效果，所以乳浊液PCR的油的配方需要优化和验证。

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以下视频提供了核酸适配体筛选过程中乳浊液PCR的步骤，供各位同仁参考借鉴。

相关文献：Yufa, R., Krylova, S. M., Bruce, C., Bagg, E. A., Schofield, C. J., & Krylov, S. N. (2015). Emulsion PCR Significantly Improves Nonequilibrium Capillary Electrophoresis of Equilibrium Mixtures-Based Aptamer Selection: Allowing for Efficient and Rapid Selection of Aptamer to Unmodified ABH2 Protein. Analytical Chemistry, 87(2), 1411-1419. doi:10.1021/ac5044187

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