磁珠偶联蛋白步骤
清洗磁珠:取100ul 磁珠使用200ul 超纯水洗3次;
活化磁珠:加入50ul EDC+50ul NHS,振荡混匀;20min 活化期间旋转避免磁珠间聚集,活化完毕,移去上清;用100ul 水洗1次;
偶联蛋白:立即加入用10mM NaAc缓冲液稀释的蛋白,终浓度在10-50ug/ml,100ul即可;NaAc缓冲液的pH值依据目标蛋白的pI来确定;通常比pI低0.5-1pH单位;也可以根据在BIACORE仪器上的preconcentration实验结果来确定;蛋白加入之后,用移液器混匀磁珠和蛋白,然后置室温反应60min,反应期间保持旋转或振荡混匀,避免磁珠聚集或沉降到底部;
封闭位点:偶联结束,并立即向磁珠中加入 pH8.5的1M 乙醇胺.HCl,反应10min,已封闭磁珠表面未反应的活化位点;
清洗磁珠:移去封闭液,磁珠用筛选缓冲液清洗5次,然后重悬于200ul筛选缓冲液中,置4度保存备用。